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本产品是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒，可以从各种酵母样本中提取膜蛋白，可用于纯化蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解酵母总膜，包括质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

• 使用方便。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液制备：
  每500μL酵母蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取适量酵母培养物，在4℃，2500×g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
  
• 用冷PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 每100～200μL体积酵母沉淀物中加入500μL酵母蛋白提取液A，混匀后，在室温或37℃条件下轻轻振荡1～2小时。
  
• 在4℃，3000×g条件下离心5～10分钟，移除上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀物中加入500μL冷的（4℃）酵母蛋白提取液B，混匀。
  
• 在2～8℃条件下轻轻振荡30～45分钟。
  
• 将提取液在4℃条件下10000×g离心5分钟，取上清。
  
• 将上清在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃ 1000×g离心3分钟。
  注：
  ● 无37℃条件离心也可室温离心，缩短离心时间至1～2分钟。
  ● 也可不离心，延长37℃水浴时间至液体澄清，分层明显即可。
  
• 此时溶液分为2层，小心移除上层部分，留下管底部下层部分大约30～50μL液体。
  注：
  ● 下层为粘稠状液体。
  
• 用50～100μL膜蛋白溶解液溶解该下层溶液，即得酵母膜蛋白样品。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度较低，需要加大细胞上样量。处理部分细胞样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。各步骤处理时温度必须按照说明书要求的温度进行。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。